菌株来源与保藏信息
生孢梭菌 ATCC 19404（Clostridium sporogenes (Metchnikoff) Bergey et al.）是 ATCC 保藏的一株经典厌氧芽孢杆菌标准菌株，BSL-1。该菌株最初由 Metchnikoff 从土壤样本中分离，属蛋白分解型梭菌（非产毒——与肉毒梭菌的区别），因不产生肉毒毒素（BoNT）而被选为肉毒梭菌的安全替代株用于灭菌验证和厌氧挑战试验。ATCC 19404 是中国药典（ChP 1101）无菌检查法中指定的厌氧菌阳性对照菌株，也是 USP 和 EP 无菌检验方法验证的厌氧代表菌。
杭州康氧以 ATCC 原装 0 代冻干粉形式提供，附 ATCC 检测报告（COA），含批号信息。操作需在厌氧工作站或厌氧罐中进行。
生物学特性
| 特征 | ATCC 19404 表现 |
|---|
| 革兰染色 | 阳性大杆菌——老龄培养物（> 48h）可呈革兰阴性（梭菌属特征） |
| 芽孢 | 卵圆、次端生——芽孢囊膨大呈梭形（"梭菌"名称由来） |
| 需氧性 | 严格厌氧——有氧条件下不生长（不同于兼性厌氧的大肠埃希菌） |
| 触酶 | 阴性 |
| 蛋白分解 | 强阳性——液化明胶、消化牛乳（产生特征性腐败气味） |
| 糖分解 | 发酵葡萄糖、麦芽糖。不发酵蔗糖、乳糖、甘露醇 |
| 吲哚 | 阴性 |
| H₂S | 强阳性 |
| 卵磷脂酶 | 阴性（与产气荚膜梭菌的关键区分——产气荚膜梭菌卵磷脂酶阳性） |
| 脂酶 | 阳性（蛋黄琼脂上产生珠光层） |
| 肉毒毒素 | 不产生——与肉毒梭菌（C. botulinum）的核心安全区分 |
| 最适温度 | 35–37°C |
在厌氧血琼脂上 37°C 培养 48h 形成直径 2–5 mm 的不规则、扁平、边缘锯齿状菌落，常产生 β 溶血环。老龄培养物（> 72h）因蛋白分解活性产生明显臭味（硫化氢、挥发性脂肪酸和胺类混合物）。
生孢梭菌ATCC 19404是一种产芽孢的革兰阳性厌氧杆菌——与产气荚膜梭菌不同，19404不产生α-毒素(卵磷脂酶阴性)且在Nagler平板上不产生乳光反应——因此BSL-1级别即可安全操作。其芽孢为卵圆形、次端生、芽孢囊膨大——在FTM(液体硫乙醇酸盐培养基)中35C孵育18-24h可形成典型厌氧带生长(培养基中上部浑浊、底部清亮)。19404在血琼脂厌氧培养48h后形成不规则边缘的灰白色菌落，伴有β-溶血环。在ChP 1101无菌检查中，19404用于验证FTM的促生长能力——若接种<100CFU的19404芽孢后3天内FTM出现浑浊，说明该批FTM合格。
厌氧培养条件与保藏
| 参数 | 推荐条件 |
|---|
| 固体培养基 | 厌氧血琼脂（含 5% 羊血或马血）、强化梭菌琼脂（RCM 琼脂） |
| 液体培养基 | FTM（硫乙醇酸盐流体培养基）——无菌检查强制使用；RCM 肉汤（强化梭菌培养基） |
| 厌氧系统 | 厌氧工作站（N₂:H₂:CO₂ = 80:10:10）、厌氧罐（AnaeroPack 或 GasPak 产气袋）、或 FTM 中上层生长（硫乙醇酸盐清除溶解氧） |
| 温度 | 35–37°C |
| 培养时间 | 48–72 h（固体）；24–48 h（液体——FTM 中的 D 值约 30–60 min） |
⚠ 厌氧操作关键：ATCC 19404 对氧气高度敏感——冻干粉开启后必须在厌氧工作站或厌氧手套箱内完成。若使用 FTM 进行无菌检查阳性对照，必须验证每批 FTM 的氧化还原指示剂（刃天青）在上层不超过 1/5 处呈粉红色（氧化区），下层无色（还原区）。若 FTM 全管粉红，说明溶解氧未充分清除——不能用于厌氧菌培养。
保藏条件
| 保藏方式 | 条件 | 存活期限 |
|---|
| TSA斜面(4C) | 封口膜密封冷藏 | 1-2个月 |
| TSB+15%甘油(-70C) | 冻存管液氮速冻 | 2年以上 |
| 冻干粉(4C) | 原装密封西林瓶 | 见ATCC检测报告 |
冻干粉复苏步骤
- 在生物安全柜中开启冻干粉西林瓶。
- 用无菌注射器加入0.3-0.5mL TSB，轻轻旋转重悬。
- 转移至TSA斜面或平板，35+/-2C孵育18-24h。
- 复苏后挑取单菌落验证纯度，确认表型合格后投入日常使用。
无菌检查法质控应用
ChP 1101 / USP 71 无菌检查法——厌氧菌阳性对照
ATCC 19404 在药典无菌检查法中承担核心角色：每批硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）在出厂前和使用前均需验证其支持厌氧菌生长的能力。无菌检验中，以 ATCC 19404 作为厌氧菌阳性对照——接种 < 100 CFU 至 FTM，30–35°C 培养应 在 3 天内出现可见生长（浑浊和/或产气）。若阳性对照未生长，该批次无菌检验结果无效——说明 FTM 的厌氧条件不达标或培养基批号不支持厌氧菌。
灭菌工艺验证——芽孢挑战
ATCC 19404 的芽孢对湿热和化学灭菌剂的中等耐受性使其在蒸汽灭菌和过氧化氢汽化灭菌验证中具有价值。其芽孢的 D₁₂₁ 值约为 0.5–1.5 min（低于嗜热脂肪芽孢杆菌 7953 和萎缩芽孢杆菌 9372），适用于验证中等严苛度的灭菌循环。与 9372（好氧）和 7953（好氧嗜热）相比，19404 作为严格厌氧菌代表，确保灭菌验证覆盖了不同需氧类型的芽孢杆菌。
与相关菌株的分工
| 菌株 | 需氧型 | 主要用途 |
|---|
| ATCC 19404 生孢梭菌 | 严格厌氧 | 无菌检查法 FTM 验证 + 厌氧菌消毒剂评价 |
| ATCC 6633 枯草芽孢杆菌 | 需氧 | 消毒剂杀芽孢评价、培养基促生长 |
| ATCC 9372 萎缩芽孢杆菌 | 需氧 | EO 灭菌 BI |
常见问题
Q: FTM 中 19404 生长了但只在底部——正常吗？
完全正常。ATCC 19404 在 FTM 中的生长模式为底部至中下层生长——因为 FTM 上层仍有微量溶解氧（氧化还原电位偏高），厌氧芽孢杆菌在还原性最强的底部优先萌发和增殖。只要培养基出现浑浊即判定为阳性生长。
Q: 如何在普通实验室（无厌氧工作站）操作 19404？
可用厌氧罐 + 厌氧产气袋（AnaeroPack 或 GasPak）替代。操作流程：在生物安全柜中快速完成接种（暴露空气时间 < 5 min），立即放入厌氧罐并激活产气袋，密封后 37°C 培养。注意：19404 的营养细胞在空气中存活时间约 10–30 min——若操作过程中菌液在空气中暴露超过 30 min，存活率下降 1–2 log，可能导致无菌检查假阴性。
Q: 19404在FTM中不生长怎么办？
首先确认FTM中刃天青指示剂——上层粉红色说明培养基未达到厌氧条件(氧气渗入)。FTM配制后应煮沸驱氧(100C 10-15min)至刃天青由粉红变为无色——冷却至45C后立即接种。若培养基本身合格，检查冻干粉复苏时是否暴露于空气中超过30min——19404为严格厌氧菌，营养细胞暴露于空气>30min将不可逆死亡。复苏应在厌氧工作站(85%N2+10%H2+5%CO2)或厌氧罐(GasPak)中进行。
Q: 19404芽孢悬液的D121值是多少？
19404的芽孢D121典型值在0.5-1.5min范围——是所有产芽孢菌中热抵抗力较低的之一。这意味着121C湿热灭菌1min即可灭活90%的19404芽孢——远短于嗜热脂肪芽孢杆菌(ATCC 7953, D121约2-3min)和萎缩芽孢杆菌(ATCC 9372)。因此在湿热灭菌验证中19404不作为主要BI——仅在验证灭菌程序对"弱耐受芽孢"的杀灭效果时使用。
订购信息
| 产品名称 | 生孢梭菌标准菌株 ATCC 19404 |
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| 拉丁名 | Clostridium sporogenes (Metchnikoff) Bergey et al. |
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| 保藏中心编号 | ATCC 19404 |
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| 产品形式 | 冻干粉（0 代原装），附 ATCC 检测报告（COA） |
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| 供应商 | 杭州康氧医疗器械有限公司 |
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技术免责声明：本文技术参数来源于公开发表的ATCC官方产品信息及相关标准文件，仅供实验室专业人员参考。杭州康氧医疗器械有限公司对因使用本文信息产生的任何后果不承担责任。如需技术咨询或产品订购，请联系杭州康氧医疗器械有限公司。
参考资料
- ATCC官网：Clostridium sporogenes 19404产品页与检测报告(COA)
- 中国药典(ChP)2020年版：通则1101无菌检查法
- USP 71 Sterility Tests
- EP 2.6.1 Sterility
- ISO 11138系列：生物指示剂标准
- Brown KL (2000): Control of bacterial spores — British Medical Bulletin review of spore resistance mechanisms
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