菌株来源与保藏信息
副溶血性弧菌 ATCC 17802(Vibrio parahaemolyticus (Fujino et al.) Sakazaki et al.)是 ATCC 保藏的一株神奈川现象(Kanagawa phenomenon,KP)阳性的副溶血性弧菌标准菌株,BSL-2。该菌株分离自日本食物中毒暴发患者的粪便标本——是副溶血性弧菌溶血素研究的经典菌株。ATCC 17802 在 GB 4789.7《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》和 ISO 21872 中作为阳性对照菌株。副溶血性弧菌是中国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原——占海产品相关食物中毒的 60–70%,17802 作为 KP 阳性的 O3:K6 血清型参考株,覆盖了绝大多数临床暴发株的毒力表型。
杭州康氧以 ATCC 原装 0 代冻干粉形式提供,附 ATCC 检测报告(COA),含批号信息。
生物学特性
| 特征 | ATCC 17802 表现 |
| 革兰染色 | 阴性弧菌——逗点状或弯曲短杆 |
| 氧化酶 | 阳性 |
| TCBS 菌落 | 绿色(蔗糖不发酵)——区别于霍乱弧菌(黄色,蔗糖发酵) |
| 神奈川现象(KP) | 阳性——我妻琼脂上 β 溶血(TDH 热稳定直接溶血素) |
| 脲酶 | 阳性——区别于创伤弧菌(阴性)和霍乱弧菌(阴性) |
| 赖氨酸脱羧酶 | 阳性 |
| 精氨酸双水解酶 | 阴性 |
| NaCl 需求 | 嗜盐——0% NaCl 不生长、3% NaCl 最适生长、8–10% NaCl 仍可生长——区别于霍乱弧菌(0% 可生长) |
| 运动性 | 单端鞭毛运动阳性——暗视野显微镜下"穿梭样运动" |
| 最适温度 | 35–37°C(倍增时间仅 10–12 min——25°C 海鲜放置 2–3 h 即可增殖到感染剂量) |
神奈川现象阳性是 ATCC 17802 区别于非致病性副溶血性弧菌(多数为 KP 阴性环境分离株)的核心特征。TDH 溶血素在血琼脂上产生完全的 β 溶血——将菌接种于含 5% 人红细胞或兔红细胞的 Wagatsuma 琼脂(高盐血琼脂),37°C 18–24 h 后在菌落周围出现清晰的完全溶血环。TDH 的溶血活性依赖于其四聚体孔形成机制——与金葡菌 α-溶血素的七聚体不同——因此在血琼脂上的溶血环外观(完全溶血但边界清晰)略有不同。
培养条件与保藏
增菌与分离
| 参数 | 推荐条件 |
| 选择性增菌 | 3% NaCl 碱性蛋白胨水(APW),36±1°C 培养 8–18 h |
| 分离琼脂 | TCBS 琼脂——绿色菌落(蔗糖阴性);科玛嘉弧菌显色培养基——紫红色菌落 |
| 非选择性琼脂 | 3% NaCl TSA、3% NaCl 血琼脂 |
| 温度 | 35–37°C |
| 培养时间 | 18–24 h |
保藏条件
| 保藏方式 | 条件 | 期限 |
| 3% NaCl TSA 斜面(室温) | 封口膜密封 | 1–2 周(副溶血性弧菌对低温和干燥敏感——4°C 冷藏反而加速死亡) |
| 3% NaCl TSB + 15% 甘油(-70°C) | 冻存管速冻 | 2 年+ |
| 冻干粉(4°C) | 原装密封 | 见 ATCC 检测报告 |
冻干粉复苏步骤
- 在生物安全柜中开启冻干粉西林瓶。
- 用无菌注射器加入 0.3–0.5 mL 3% NaCl TSB,轻轻旋转重悬。
- 取一接种环划线至 TCBS 琼脂 + 3% NaCl TSA 平板,35–37°C 孵育 18–24 h。
- TCBS 上验证绿色菌落 + 氧化酶阳性 + 3% NaCl TSA 上验证生长——同时接种 0% NaCl 蛋白胨水验证无生长(排除霍乱弧菌污染),确认后挑取单菌落保存。
⚠ 保藏提醒:副溶血性弧菌对低温和低渗环境敏感——切勿将工作菌种斜面放置于 4°C 冷藏!冷藏 24 h 后存活率可下降 80–90%。日常使用的工作斜面应室温保存且每周传代一次。
质控应用
海产品检验(GB 4789.7)
ATCC 17802 是 GB 4789.7 指定的阳性对照——检验流程为 3% NaCl APW 增菌(36°C 8–18 h)→ TCBS 分离 → 氧化酶试验 → 3% NaCl TSA 纯培养 → 生化鉴定(VITEK GN卡或 API 20E)。KP 阳性(神奈川试验阳性)是临床致病株的确证标准——KP 阴性的环境分离株不可报告为致病性副溶血性弧菌,仅 17802(KP+)可用于阳性对照和方法验证。
消毒剂效力评价
副溶血性弧菌在海水和海洋沉积物中以活的非可培养状态(VBNC)形式越冬——VBNC 细胞对消毒剂的耐受性显著高于对数期培养物。ATCC 17802 的 VBNC 诱导是海产品加工消毒验证的重要补充——将 17802 在人工海水(3% NaCl,4°C)中冷休克诱导 30–40 天后用 LIVE/DEAD BacLight 染色验证 VBNC 诱导率(> 90% 绿色活细胞但 TCBS 上不可培养),再用于消毒剂暴露后的复苏验证。
常见问题
Q: TCBS 上 17802 的菌落是黄色的——是不是菌株退化了?
不是退化。TCBS 琼脂的质量批次差异是主要原因——酵母提取物和蛋白胨中的蔗糖本底含量因厂家不同有波动。若 TCBS 中本底蔗糖 > 0.2 g/L,即使是蔗糖阴性的副溶血性弧菌也会出现微黄色菌落(弱阳性)。解决方案:平行接种一株已知蔗糖阳性菌(如霍乱弧菌 ATCC 14035)——若全部菌落均为黄色,问题在 TCBS 批次而非菌株。
Q: KP 试验(神奈川现象)怎么做最可靠?
使用我妻琼脂(Wagatsuma agar)——成分为酵母提取物 + 蛋白胨 + NaCl 7% + 甘露醇 + 结晶紫 + 5% 洗涤人红细胞(O 型血最佳,兔血次之)。37°C 18–24 h 后观察溶血环。关键控制:(1)红细胞必须洗涤——血清残留补体会产生假阳性;(2)NaCl 浓度严格 7%——偏差错配影响 TDH 的亚基聚合;(3)阳性对照用 ATCC 17802、阴性用 ATCC 17802 煮沸灭活的死菌或 ATCC 33846(KP 阴性参考株)。
Q: 冷藏海产品为什么还是检出副溶血性弧菌?
因为 VBNC 状态(活的非可培养状态)。17802 在 4°C 海产品表面进入 VBNC 状态——TCBS 上不可培养但 BacLight 染色显示膜完整性保持 > 80%。VBNC 细胞在室温复温 2–3 h 后恢复可培养性——这是冷藏海产品中副溶血性弧菌"假阴性→室温放置后阳性"现象的原因。标准检验流程中的 APW 增菌步骤(36°C)正是为了复苏 VBNC 细胞——若 APW 增菌后 TCBS 仍无生长,才算真阴性。
订购信息
| 产品名称 | 副溶血性弧菌标准菌株 |
| 拉丁名 | Vibrio parahaemolyticus(O3:K6) |
| 保藏中心编号 | ATCC 17802 |
| 参考信息 | KP 阳性(TDH+)/ GB 4789.7 阳性对照 / TCBS 绿色菌落 |
| 产品形式 | 冻干粉(0 代原装),附 ATCC 检测报告 |
| 存储条件 | 2–8°C 避光保存 |
如需批量订购或技术咨询,请联系杭州康氧医疗器械有限公司。
参考资料
- GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》
- ISO 21872-1:2017 Horizontal method for the detection of Vibrio parahaemolyticus
- ATCC 官网:Vibrio parahaemolyticus 17802 产品页与检测报告(COA)
- Nishibuchi M & Kaper JB (1995): Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus — Infection and Immunity
- Oliver JD (2005): The viable but nonculturable state in bacteria — Journal of Microbiology
- Su YC & Liu C (2007): Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety — Food Microbiology
技术免责声明:本文技术参数来源于公开发表的 ATCC 官方产品信息及相关标准文件,仅供实验室专业人员参考。杭州康氧医疗器械有限公司对因使用本文信息产生的任何后果不承担责任。如需技术咨询或产品订购,请联系杭州康氧医疗器械有限公司。