菌株来源与保藏信息
枯草芽孢杆菌 ATCC 6633（Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn）是 ATCC 保藏的一株经典需氧芽孢杆菌标准菌株，BSL-1。该菌株最早从土壤样本中分离，因其产芽孢能力强、芽孢耐热性适中、对不同化学消毒剂和灭菌工艺具有可重复的敏感谱，被全球各版药典（ChP、USP、EP）和国际消毒剂标准（EN、AOAC）广泛采纳为芽孢类挑战菌株。ATCC 6633 的标准化芽孢悬液制备工艺成熟，不同批次的芽孢在热抵抗力（D 值）和化学耐受性方面具有良好的一致性。
ATCC 产品形式包括 6633（冻干粉营养细胞——需自行制备芽孢悬液）和衍生产品。完整基因组已测序，GenBank 登录号 NZ_CP034484。
杭州康氧以 ATCC 原装 0 代冻干粉形式提供，附 ATCC 检测报告（COA），含批号信息。
生物学特性
枯草芽孢杆菌 ATCC 6633 的营养期细胞为革兰阳性大杆菌（0.7–0.8 × 2–3 μm），周鞭毛活跃运动。在营养耗竭条件下（碳源或氮源限制），细胞启动芽孢形成级联反应：Spo0A 磷酸化 → σF/σE/σG/σK 依次激活 → 约 8–12h 完成成熟芽孢。成熟芽孢呈椭圆、中生至次端生，芽孢囊不膨大。
| 特征 | ATCC 6633 表现 |
|---|
| 革兰染色 | 阳性大杆菌（营养期）；芽孢不着色 |
| 芽孢形态 | 椭圆、中生至次端生，芽孢囊不膨大 |
| 触酶 | 阳性 |
| V-P 试验 | 阳性（产乙偶姻） |
| 淀粉水解 | 阳性 |
| 硝酸盐还原 | 阳性（产亚硝酸盐及氮气） |
| 酪素水解 | 阳性 |
| 明胶液化 | 阳性（快速） |
| 溶血性 | β 溶血（弱至中等，血琼脂上可见） |
| 菌落特征 | TSA 上干燥、粗糙、边缘不规则——与金黄色葡萄球菌的光滑菌落极易区分 |
| 最适温度 | 30–37°C |
营养琼脂上 37°C 培养 24h 后菌落呈不规则扩散状、表面褶皱如"地衣状"。该菌落在 48h 后因芽孢大量形成而颜色加深至浅棕色。
枯草芽孢杆菌ATCC 6633的芽孢形成机制已被充分解析——Spo0A磷酸化级联依次激活σF/σE/σG/σK因子，约8-12h完成芽孢成熟。成熟芽孢对湿热(121C需5-15min灭活)、UV和化学消毒剂具有显著耐受性——芽孢皮层中的吡啶二羧酸(DPA)与钙离子螯合物是芽孢耐热性的分子基础。6633芽孢在无菌检查培养基促生长验证中不可替代——不同批次的D121值变异系数控制在15%以内，标准化程度高于其它芽孢杆菌。
培养条件与芽孢悬液制备
复苏与营养期培养
| 参数 | 推荐条件 |
|---|
| 固体培养基 | TSA、营养琼脂、锰盐琼脂（促芽孢形成） |
| 液体培养基 | TSB、营养肉汤、芽孢形成专用培养基（如 Schaeffer 培养基：营养肉汤 + 0.1% KCl + 0.012% MgSO₄ + 10⁻⁶ M MnCl₂） |
| 温度 | 30–37°C |
| 培养时间 | 18–24 h（营养期）；48–72 h（芽孢形成，至 > 90% 产芽孢率） |
芽孢悬液制备（标准流程）
- ATCC 6633 接种锰盐琼脂或 Schaeffer 琼脂平板，37°C 培养 48–72h。
- 取少量菌苔涂片做芽孢染色（孔雀绿-番红），显微镜检查芽孢率 ≥ 90% 方可收集。
- 用无菌冷生理盐水（4°C）冲洗平板表面，收集菌苔至无菌离心管。
- 4°C 条件下 10,000 × g 离心 10 min，弃上清。
- 重悬于冷无菌水，重复离心洗涤 3–4 次去除残留营养细胞碎片和萌发因子。
- 65–70°C 水浴处理 20 min（热休克——灭活残余营养细胞，同时激活芽孢同步萌发）。
- 冷却至室温，重悬于无菌水或 PBS，分装冻存（4°C 短期，-20°C 长期）。
⚠ 芽孢悬液制备关键：热休克温度不可超过 80°C——ATCC 6633 芽孢在 > 85°C 下存活率急剧下降（D₈₅≈ 5–10 min）。每次制备的芽孢悬液应做存活计数（涂 TSA，37°C 24h 计数 CFU/mL）并记录孢子/营养细胞比率。芽孢悬液在 4°C 无菌水中可稳定保存 6 个月以上。
保藏条件
| 保藏方式 | 条件 | 存活期限 |
|---|
| TSA斜面(4C) | 封口膜密封冷藏 | 1-2个月 |
| TSB+15%甘油(-70C) | 冻存管液氮速冻 | 2年以上 |
| 冻干粉(4C) | 原装密封西林瓶 | 见ATCC检测报告 |
冻干粉复苏步骤
- 在生物安全柜中开启冻干粉西林瓶。
- 用无菌注射器加入0.3-0.5mL TSB，轻轻旋转重悬。
- 将菌悬液全部转移至TSA斜面或平板，35+/-2C孵育18-24h。
- 复苏成功后挑取单菌落验证纯度和关键表型，确认合格后方可投入日常使用。
质控与标准化应用
消毒剂效力评价——芽孢挑战代表
在 EN 13704（化学消毒剂杀芽孢定量悬浮试验）和 EN 17126（医疗器械消毒剂杀芽孢效力）中，ATCC 6633 芽孢被指定为需氧芽孢杆菌的代表挑战株。枯草芽孢杆菌芽孢对过氧乙酸、戊二醛、过氧化氢等高水平消毒剂敏感（适当接触时间可达 ≥ 4 log reduction），但对季铵盐类、双胍类和乙醇的耐受性显著高于营养细胞——含 70% 乙醇的消毒剂接触 10 min 对 ATCC 6633 芽孢的 log reduction 通常 < 1，对 6538（金葡菌营养细胞）则可 > 5。这提示产品如宣称"杀菌"vs"杀芽孢"需要完全不同的验证标准。
培养基促生长验证
在药品微生物限度检查（ChP 1105、USP <61>）中，每批新配制的 TSA 或营养琼脂须经过促生长验证——接种 ≤ 100 CFU 的 ATCC 6633，37°C 培养 24h 应形成可见菌落。ATCC 6633 作为需氧芽孢菌代表，其独特的粗糙菌落形态使其即使与光滑菌落（如金葡菌、大肠埃希菌）混合接种也能清晰辨别。
环氧乙烷（EO）灭菌验证
ATCC 6633 芽孢对环氧乙烷灭菌具有中等至偏高的耐受性（D 值约 2–5 min，取决于 EO 浓度、温度和湿度），常用于 EO 灭菌循环验证的生物指示剂开发。虽然 ATCC 9372（萎缩芽孢杆菌）是 EO 指示剂的标准菌株（D 值更高），但 6633 在验证中等严苛度的 EO 工艺时仍具有应用价值。
与相关芽孢菌株的分工
| 菌株 | 芽孢耐热性 | 主要用途 |
|---|
| ATCC 6633 | 中等（D₁₂₁≈0.5–1 min） | 消毒剂杀芽孢评价、培养基验证 |
| ATCC 9372 | 较高（D₁₂₁≈2–3 min） | EO 灭菌指示剂、干热灭菌验证 |
| ATCC 7953 | 极高（D₁₂₁≈1.5–2 min） | 蒸汽灭菌生物指示剂 |
常见问题与注意事项
Q: 为什么制备的芽孢悬液热休克后存活率很低（< 50%）？
排查三方面：① 收集时间——芽孢形成不足 48h 或过度老化（> 7 天自溶）都会降低存活率；② 热休克温度——确认水浴温度准确（不超过 70°C）；③ 洗涤步骤——离心力过大（> 12,000 × g）可能机械损伤芽孢外层，建议使用 5,000–8,000 × g。
Q: 消毒剂杀芽孢试验中应该用芽孢还是营养细胞？
必须用纯化芽孢悬液。若产品宣称"杀芽孢"，法规要求挑战物必须是 > 90% 的芽孢悬液（芽孢染色验证）。不能用营养细胞替代——营养细胞对消毒剂的敏感性远高于芽孢，会导致效力虚高。
Q: 营养琼脂上的 6633 菌落蔓延太严重，怎么控制？
枯草芽孢杆菌的活跃运动性使其在湿润琼脂表面容易蔓延（swarming）。解决方案：① 使用干燥良好的琼脂平板（新鲜倒板后在 37°C 烘干 30 min 去除表面水分）；② 降低琼脂浓度至 1.2–1.3%（标准 1.5% 的较软琼脂有利于蔓延）；③ 采用划线分离而非涂布法。
Q: 6633芽孢悬液的D值怎么测定？
使用分馏法(fraction-negative method)或存活曲线法。将芽孢悬液分装至毛细管中，121C油浴，在0/1/2/3/5/8min时间点取样——各时间点接种3管TSB，35C孵育7天。用Spearman-Karber法计算D值。ATCC 6633的D121典型值在2-3min范围内。
Q: 6633可以代替9372用于EO灭菌验证吗？
不可以。虽然同为需氧芽孢杆菌，6633的芽孢对环氧乙烷的耐受性显著低于9372(DEO值约差2-4倍)。ISO 11135明确指定9372为EO灭菌BI参考菌株——使用6633替代将严重低估灭菌程序所需的EO暴露时间，导致灭菌验证不通过。
订购信息
| 产品名称 | 枯草芽孢杆菌标准菌株 ATCC 6633 |
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| 拉丁名 | Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn |
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| 保藏中心编号 | ATCC 6633 |
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| 产品形式 | 冻干粉（0 代原装），附 ATCC 检测报告（COA） |
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| 供应商 | 杭州康氧医疗器械有限公司 |
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技术免责声明：本文技术参数来源于公开发表的ATCC官方产品信息、CLSI文件及现行药典标准，仅供实验室专业人员参考。杭州康氧医疗器械有限公司对因使用本文信息产生的任何后果不承担责任。如需技术咨询或产品订购，请联系杭州康氧医疗器械有限公司。
参考资料
- ATCC官网：Bacillus subtilis 6633产品页与检测报告(COA)
- 中国药典(ChP)2020年版：通则1105、1106微生物限度检查
- EN 1040/EN 1276消毒剂定量悬浮试验标准
- ISO 11138系列生物指示剂标准
- Setlow P (2006): Spores of Bacillus subtilis—properties and resistance mechanisms
- Nicholson WL et al. (2000): Resistance of Bacillus endospores to extreme environments
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